Mary Elizabeth Mastrantonio, 17 Kasım 1958'de Lombard, Illinois'de doğdu. Babası Peter Mastrantonio, bir otomobil satıcısıydı, annesi Mary D. Mastrantonio, ise hemşireydi. Mastrantonio, vedebazı Illinois Üniversitesi'nden mezun oldu ve daha sonra Chicago Dramatic Art Sanat Merkezi'nde oyunculuk eğitimi aldı. Rol almaya başladığında, kendi isiminden esinlenerek sahne adını "Mary Elizabeth" olarak seçti.
Mastrantonio, sinema dünyasına 1980'lerin başında adım attı ve ilk olarak "The Thing" ve "Scarface" filmlerinde küçük rollerde göründü. 1986'da başrolünde yer alan "The Color of Money" filmindeki performansıyla övgü kazandı ve bu film ona Akademi Ödülü ve Altın Küre Ödülü için aday gösterildi.